二级生物安全柜同一级生物安全柜一样，气体也是从外部流入二级生物安全柜，通常称为进流。进流能够防止微生物操作时产生的气溶胶从安全柜前面操作窗口逃逸到实验室内。然而，它们不同于一级生物安全柜之处为，只让经HEPA过滤的（无菌的）空气流过工作台面。内置风机将空气经前面的开口引入安全柜内并进入前面的进风格栅。因此没有经过过滤器过滤的空气不会直接进入工作区，从而保护安全柜内部存放的样品和仪器不被外界空气所污染。
二级生物安全柜的一个特征就是由垂直层状薄片的(无定向的)HEPA过滤器过滤后，再安全柜内部形成向下流动的气流。气流不断地冲能可产生空气传播感染的安全柜内部，从而避面存放在柜体内的样品受到感染。这样的气流被称作下沉气流。
不同型号的二级生物安全柜的主要区别在于：排气的比例以及气体经过空气高压再循环的比例不同。另外，不同的二级生物安全柜具有不同的排气方式：有的安全柜将空气过滤后直接排到室内，有的是通过连接到专用通风管道上的套管或通过建筑物的排风系统排到建筑物外面。
除了以上所提及的不同之外，所有的二级生物安全柜同1级生物安全柜一样，能够保护操作人员和实验室环境免受危害。另外，二级安全柜也能够保护产品样本在微生物操作过程中免受污染。二级生物安全柜可以在一，二，三级生物安全水平的生物因子操作中使用。
